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渗透压调节基因proBA的融合表达对大肠杆菌耐高渗胁迫能力的影响

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微 生 物 学 报 !"#$ %&"’()&(*(+&"$ ,&-&"$

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渗透压调节基因 .’(/! 的融合表达对大肠杆菌 耐高渗胁迫能力的影响
刘瑞杰


陈 婷

曹军卫"
武汉 !3%%2$)

(武汉大学生命科学学院

要: 枯草芽孢杆菌 B3#"# 的渗透压调节基因 !"#$ 和 !"#% 以重叠基因的方式组织, 但是表达两个单独的蛋白质 在抗脯氨酸反馈抑制耐盐突变菌株 B3#"#7#! 的 !"#$% 基因重叠区引入一个限制性酶 E-’F 和 E-’G。通过引物设计, 切位点, 分别扩增出 !"#$ 和 !"#% 基因, 并构建融合的 !"#$% 基因。 HIH7EGJ8 分析显示有一条新的分子质量约为 5"KI 的蛋白带出现。相对于表达未融合的 !"#$ 和 !"#% , !"#$% 融合基因的表达明显提高了宿主菌大肠杆菌 LM53 胞内游离脯氨酸含量和其耐高渗胁迫能力。 关键词: 枯草芽孢杆菌, 脯氨酸, 融合基因, 耐高渗胁迫能力 中图分类号: 文献标识码: 文章编号: NB3 G %%%#76$%B($%%")%#7%%$37%!
[#] [$] 脯氨酸是许多生物 (如细菌 、 藻类 、 以及高 [3] 等植物 ) 为适应胞外水势的降低而在胞内积累的 相容溶质。微生物在高渗胁迫条件下, 既可以利用 胞外吸收, 也可以通过胞内从头合成的方式积累脯 (! 氨酸。其合成以谷氨酸为底物, 经! 7谷氨酸激酶 7 、 (! 7谷氨酸磷酸还原酶 7 8P $D2D$D##) JO 或 E-’F, ! 和吡咯啉7"7羧酸还原酶 8P #D$D#D!#) JEQ 或 E-’G, ( E"PQ 或 E-’P, 它们分 8P #D"D#D$) 3 种酶催化合成, [#] 别由 !"#$ 、 !"#% 和 !"#& 基因编码 。高等植物中, 脯氨酸的合成也以谷氨酸为底物, 由吡咯琳7"7羧酸 # 合成酶 (" 和 7R0--’(:A+7"7;/-,’S0(/T+ U0AT?+T/U+,E"PH) # 吡 咯 琳7"7羧 酸 还 原 酶( " 7R0--’(:A+7"7;/-,’S0(/T+ 催化合成, 其中 E"PH 具有细菌中 -+@.;T/U+,E"PQ) [!] 7JO 和! 7JEQ 的双重功能 。 E"PH 在转基因植物 ! [", 6] 中的表达, 显著提高了植物的耐高渗胁迫能力 。 在大多数的细菌中, !"#$ 和 !"#% 基因在基因组 中紧密连锁, 组成了一个操纵子, 由 !"#$ 基因的启 动子 负 责 !"#$% 基 因 的 转 录。 不 同 的 微 生 物 中, 一般以长度 !"#$ 和 !"#% 基因的组织方式是不同的, 不同的连接区或者部分重叠的方式组织。如大肠杆 [2] 菌的 !"#$ 和 !"#% 基因相隔 ## 个碱基 , 而在单核 细胞增生利斯特氏菌 ( ’()*+"(, -#.#/0*#1+.+) ) 中, !"#$ [5] 与 !"#% 基因重叠了 #2 个碱基 。这种重叠的基因 组织方式可能有利于 ! 以 7JO 和 ! 7JEQ 相互靠*, [5, B] 复合体的形式共同起作用 。 本室获得了枯草芽孢杆菌抗脯氨酸结构类似物 耐盐 突 变 株 B3#"#7#!, 克 隆 出 其 !"#$% 基 因, 发现 !"#$ 和 !"#% 是以重叠基因的方式组织的, !"#$ 基因

的前两个碱基 4J 与其上游第 # 终止密码子 ( 4JG) 个碱基 G 组成了 !"#% 基因的起始密码子, 且 !"#$ [#%] 基因第 25# 位由 4 突变为 G 。尽管 !"#$% 基因是 以重叠的方式组织的, 但仍以分离的方式表达 E-’F 和 E-’G 两个蛋白。同时发现突变株的 !"#$% 基因 在大肠杆菌 LM53 中表达, 显著提高了宿主菌耐高渗 [##] 胁迫能力 。为获得融合的 !"#$% 基因, 以研究其 表达对宿主菌耐高渗胁迫能力的影响, 本研究通过 去 在 !"#$ 和 !"#% 基因重叠区添加酶切位点的方法, 掉 !"#$ 的终止密码子, 将 !"#$ 和 !"#% 基因连接起 来, 表达了一个大的融合蛋白。并分析了融合基因 的表达对大肠杆菌 ( 2)/3+"(/3(, /#4( ) 耐盐能力的影响 和胞内游离脯氨酸积累之间的关系, 为 !"#$% 融合 基因转基因植物研究工作打下了基础。

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材料和方法

!"! 材料 枯草芽孢杆菌 B3#"#7#! 为本实 !"!"! 菌株和质粒: [#%] 验室已获得的抗脯氨酸结构类似物耐盐突变株 ; 7 ( !"#$% ) 由德国 大肠 杆 菌 ( 2)/3+"(/3(, /#4( ) LM53 [#$] HK+--/ 教授赠送; RF8$ 表达载体由武汉大学沈 萍教授赠送; RF&$$% 热诱导表达载体由湖北大学马 立新教授赠送。 连接酶、 限制性内切酶购自 4/O/Q/ !"!"# 主要试剂: 公司。 5,6 酶、 回收试剂盒为 I1G MFV 公司产品。 [#3] ; !"!"$ 培养基: WF 培养基配制方法参照文献 [#$] (M:A:9/( M+@:.9) 培养基采用 *:+@(+- 的方法配 MM 制。

基金项目: 武汉大学科技创新基金 ($%!$2%%$3)
" 通讯作者。 4+(: 567$275252$#32; 879/:(: ;/’<=> =?. ) +@. ) ;A

作者简介: 刘瑞杰 (#B25 C ) , 男, 山东临沂人, 硕士研究生, 研究方向为嗜极微生物分子生物学。 879/:(: -.:<:+7B2 > #63D ;’9 收稿日期: $%%!7%67#!,修回日期: $%%!7%B7$3

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D$ 卷

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!"#$ 基因终止密码子的去除与基因克隆 在设计引物扩增 !"#$ 基因时, 在其最后一个氨 基酸密码子 !!! 和 !"#% 基因起始密码子 !"# 之间 添加一个 &’( ! 限制性酶切位点, 将其终止密码子 去 掉。 上 游 引 物 为:$%&##’’"#’!#!’##!##!# ( 含 )*+ ! 酶 切 位 点) , 下 游 引 物 为: $%& !!!’"!&(% (含 &’( ! 酶切位 ##’"’"!#!"""#""""’’’’’"’&(% ( +$ ) : 点) 。 )’* 反 应 体 系 , -. / 012234 +5$ ,, " " 上下游引物各 67’8++99:8;,, <=")> 各 .5+99:8;,,

[-D] 胞内蛋白质样品制备参照翟 超等 的方法。 挑取 I6J( ( FGO++.& !"#$% ;6M) 和已经构建的含有突 变 株 !"#$% 基 因 的 转 化 子 I6J( ( FGO++.& !"#$% ; [--] 单菌落, 接种到含有 !9F 的 ,G 液体培养基 6) 按 -P 接 种 量 转 接。培 养 至 中, (.A 过 夜 培 养 后, 立即转到热诱导温度 D+A , 继续 12$$. 值约 .5D 时,

-. 9:8;,, ,(- 酶 -5(?。以下反应体系各物质的浓 " 度相同。 )’* 反应条件: @$A $9BC; @DA (.>, $$A , , 共 个循环; 。 产 E+A (9BC (. E+A -.9BC )’* -9BC 物纯化后经 )*+ !和 &’( !双酶切, 连接到同样双酶 转 化 大 肠 杆 菌 I6J( 切并 纯 化 的 FGH+ 载 体 上, ( !"#$% K ) , 涂布 !9F 抗性的 ,G *板上 (EA 培养。 提取重组质粒, 经双酶切筛选出阳性转化子。 !"$ !"#% 基因的克隆和含融合基因的重组质粒的 构建 扩增 !"#% 基因的上游引物添加了与 !"#$ 基因 下游引物同样的 &’( !酶切位点。 !"#% 基因 )’* 产 构建成含融合 物经双酶切连接到 !"#$ 基因的下游, 基因 的 重 组 质 粒。上 游 引 物 为 $%&##’"’"!#!!" ( 含 &’( ! 酶切位点) , 下游 引 #!#"#!!#"!""#&(% 物 为 $%&##’#!#’"’!"’#"’!!"’"’’’’#’!’!&(% (含 .(/ !酶切位点) 。 )’* 反应条件除退火温度为 $-A 外同上。 )’* 产物纯化后经 &’( ! 和 .(/ ! 双 酶切, 连接到同样双酶切的已经插入 !"#$ 基因的 转化大肠杆菌 I6J(, 涂布 !9F 抗 FGH+& !"#$ 质粒上, 性*板 (EA 培养。质粒经双酶切和 L=! 测序确认 筛选出含有 !"#$% 融合基因重组质粒的阳性转化 子, 命名为 I6J( ( FGH+& !"#$% ;6M) 。 !"% !"#$% 融合基因的功能互补鉴定 挑取 I6J( ( FGH+& !"#$% ;6M) 单菌落划线接种到 重新 66 培养基*板上, (EA 培养。待菌落长出后, 以进一步鉴定。 划线接种到 66 培养基上, !"& !"#$% 融 合 基 因 的 克 隆 和 表 达 产 物 的 ’(’) *+,- 分析 以质粒 FGH+& !"#$% ;6M L=! 为 L=! 模板, 扩增 !"#$% 融 合 基 因。 上 游 引 物 为: $%&##’##!"’’# (含 $(0 N! 酶切位点) , 下游 !!!’"!"#!!!!!#&(% 引 物:$%&!#’’"#’!#’""!!!!!#!’"!"!’&(%( 含 。 )’* 反应条件除退火温度为 $(A )*+ !酶切位点) 外同 -5D 节。 )’* 产物经 $(0 N! 和 )*+ ! 双酶切 并纯化后, 连接到经同样双酶切并纯化的表达载体 转化大肠杆菌 I6J( ( !"#$% K ) 。提取质 FGO++. 上, 粒, 双 酶 切 鉴 定 出 阳 性 转 化 子,命 名 为 I6J( ( FGO++.& !"#$% ;6M) 。

培养 DQ 后, 离心收集菌体, 加入 -.. , - / 上样缓冲 " 液重悬菌体, 取上 -..A 煮沸 $9BC, -....4;9BC 离心, 清进行 RLR&)!#H 分析。 !". /01$ 转化子耐高渗胁迫能力的测定 分别挑取 I6J( ( FGH+& !"#$% ;6) 和 I6J( ( FGH+& 单菌落, 接种到含有 !9F 抗性的 ,G 液体 !"#$% ;6M) 离心收集菌体, 用 66 培养 培养基中, (EA 培养 -.Q, 基洗涤两次后, 转接到 66 液体培养基中, (EA 培养 至对数生长后期, 再按适当比例转接到含不同 =S’8 浓度 (.5(,.5D,.5$,.5T 9:8;, ) 的 66 培养基中, 使初始 12$$. 值约为 .5.(, (EA , ++.4;9BC 震荡培养。 每 +Q 测定一次 12$$. 值, 以培养时间为横坐标, 以 绘制生长曲线。转化子的最高耐 12$$. 值为纵坐标, 盐能力定义为: 转化子在上述振荡培养时若 DJQ 内 同其 12$$. 值没有变化说明在此盐浓度下不能生长, 他盐梯度的生长情况对比, 我们就可以初步确定最 高耐盐能力。 !"2 胞内游离脯氨酸含量的测定 [-$] 的方法测定大肠杆菌 I6J( 转化 按 UQSV9:43 子胞内的游离脯氨酸含量。

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结果和讨论

!"#$% 融合基因的构建 在前期的研究工作中, 我们发现 !"#$ 和 !"#% 首 尾重叠。 !"#$ 基因终止密码子 ( "#!) 的前两个碱基 "# 与其上游第 - 个碱基 ! 组成了 F4:! 基因的起始 [-.] 密码子 。尽管 !"#$% 基因以重叠的方式组织, 但 仍以分离的方式表达 )4:G 和 )4:! 两个蛋白。其中 编码一个由 (E. 个氨基酸组成 !"#$ 基因为 ---(0F, [-.] 的蛋白质分子 , 编码一个由 !"#% 基因为 -+DJ0F, [ ] D-$ 个氨基酸组成的蛋白质 -- 。为获得 !"#$% 融合 基因, 本研究在设计下游引物扩增 !"#$ 基因时, 经 在其最后一个氨基酸密码子 !!! 末端插入 E 个核 苷酸 !"’"!#!, 即引入一个限制性酶切位点 &’(! , 以扩增出没有终止密码子 "#! 的 !"#$ 基因。 !"#% 基 因上 游 引 物 同 样 添 加 了 &’( ! 酶 切 位 点。 这 样 (编码丝氨酸和精氨 &’( !酶切位点做为一个 ,BCW34 酸) 将 !"#$ 和 !"#% 基 因 连 接 起 来 置 于 FGH+ 载 体 R)T 启动子的下游。 实验中, 以突变株 @(-$-&-D 基因组为模板, 第 一次克隆出 !"#$ 基因, 将 !"#$ 基因连接到 FGH+ 表

&期

刘瑞杰等: 渗透压调节基因 !"#$+ 的融合表达对大肠杆菌耐高渗胁迫能力的影响

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达载体上。重组质粒 ( !"#$% !"#$ ) 经 %&’ ! 和 ()* ! 双酶切, 能够切下约 &’&() ( !"#$ 基因) 的片段, 说明 !"#$ 基因已连接到 !"#$ 表达载体上。然后将扩增 的 !"#+ 基因连接到已经含有 !"#$ 基因的重组质粒 ( !"#$% !"#$+ ) 经 ()* ! 和 !"#$% !"#$ 上。重组质粒 能切下一条约 &’$() ( !"#+ 基因) 大小 ,*- !双酶切, 获得了一条 的带, 同时采用 %&’ ! 和 ,*- ! 双酶切, ( !"#$+ 融合基因) , 说明 !"#$+ 基 约 $’* () 的产物 因已经成功的连接到 !"#$ 表达载体上。经测序鉴 定, 表明酶切位点已经如所设计的方式成功地插入, 将两个基因连接起来, 并且没有突变产生。 !"! !"#$% 融合基因的功能互补鉴定 利用功能互补的方法来鉴定 !"#$+ 融合基因表 达产物的活性。将 +,-. ( !"#$% !"#$+ /,0) 划线接种 经过 &$3 到不含脯氨酸的 ,, 培养基上, .12 培养, 就能长出菌落。第二次划线 -3 就能长出菌落。说 明融合以后的 !"#$+ 基因能够表达有活性的产物, 从而催化合成脯氨酸, 使 +,-. 菌株在基本培养基中 获得很好的生长。 !"# 融合基因表达产物的 $%$&’()* 分析 为了验证获得的 !"#$+ 融合基因是否表达为融 将 !"#$+ 融合基因克隆到 !"8$$9 合的 456"7 蛋白, 表达载体上, 在大肠杆菌 +,-. 内进行了表达。表达 (图 &) 。可见含有非融合基 产物经 :;:%47<# 分析 因重组质粒的 +,-. ( !"8$$9% !"#$+ /,) 表达出两种 ( 456") 和 *=(;( 4567) 蛋白, 分子量分别约为 *9(; (图 &, 泳道 $, 。而表达 !"#$+ 融合基因的细胞显 .) (图 &, 泳道 &) , 在 示有一条约 -=(; 的新蛋白带产生 但 *=(; 处 4567 的蛋 *9(; 处的 456" 蛋白质带消失, 白质带仍旧存在。这说明融合的 !"#$+ 基因确实能 够表达一个大的融合蛋白。*9(; 处的 456" 蛋白质 不 带消失, 是由于 !"#$ 基因被去除了终止密码子, 能单独表达, 这也验证了我们对 !"#$ 基因终止密码 [&9] 是由于 子的推测 。而 !"#+ 基因之所以仍能表达, 其基因和推测的 :; 序列均没有被改变之故。

!"5 !"#$% 融合基因的表达对大肠杆菌 ,-.# 耐 高渗胁迫能力和胞内游离脯氨酸积累的影响 为了解 !"#$+ 融合基因的表达对宿主菌耐高渗 胁迫能力的影响, 测定 +,-. ( !"#$% !"#$+ /,0) 在含 (图 $) 。 不同 NAOC 浓度液体 ,, 培养基中的生长

图 ! 不 同 盐 浓 度 下 ,-.# ( /0*!& !"#$% 3-4 ) 和 ,-.# (/0*!& !"#$% 3-) 的生长比较
0>?@$ <56PL3 K6M!A5>E6B )GLPGGB +,-.( !"#$% !"#$+ /,0) ABI +,-. (!"#$% !"#$+ /,)>B I>FFG5GBL NAOC K6BKGBL5AL>6BE ,6!GB EDM)6CE A5G +,-. Q3G L3>K( EDM)6CE A5G +,-.(!"#$% !"#$+ /,0) (!"#$% !"#$+ /,) @

图+

表达产物的 $%$&’()* ,-.#(/01!!2& !"# 0(3-4)

0>?@ & :;:%47<# ABACDE>E 6F GH!5GEE>6B !56IJKLE 6F +,-.( !"8$$9% !"#$+ /,0) ;$ ABI .’ +,-.(!"8$$9%!56"7/,) ; &’ +,-.(!"8$$9%!56"7/,0) ;=’ 456LG>B MA5(G5 @ *’ +,-.(!"8$$9)

从图 $ 可 以 看 出, 随 着 盐 浓 度 的 上 升, +,-. (!"#$% !"#$+ /,0) 和 +,-.( !"#$% !"#$+ /,) 生长的延 迟期和到达稳定期的时间都延长。而在同一盐浓度 均比 +,-.( !"#$% !"#$+ / 下, +,-.( !"#$% !"#$+ /,0) 生长的延迟期和达到稳定期的时间要短, 说明其 ,) 生长 更 快, 代 时 要 短。在 进 一 步 的 实 验 中, +,-. (!"#$% !"#$+ /,0) 最高耐盐能力为 9’RM6C/S NAOC, 而 最 高 只 能 耐 9’=M6C/S NAOC。 +,-.( !"#$% !"#$+ /, ) 与非融合基因的表达相比, 融合基因的表达使宿主 细胞的耐盐能力提高了 $9T , 说明构建的融合基因 确实提高了 +,-. 宿主细胞的耐高渗胁迫能力。 将 +,-. ( !"#$% !"#$+ /,0 )和 +,-. ( !"#$% 细胞分别接种于含 9’=M6C/S NAOC 的 ,, !"#$+ /,) 培养基中培养 &$3, 测定了其胞内的游离脯氨酸含 ( !"#$% !"#$+ /,0) 的胞内游离脯氨酸含量 量。 +,-. 为 $99’R. 干细胞, 而 仅为 ?/? +,-.( !"#$% !"#$+ /,) " &.9’9. ?/? 干细胞。与表达非融合基因的宿主细胞 " 相比, 融合基因的表达使 +,-. 宿主细胞胞内游离脯 氨酸含量提高了 =*’.T 。这种胞内游离脯氨酸含 量的差异, 是 +,-.( !"#$%!56"7/,0) 生长快, 能耐更 [&R] 高渗透压胁迫的原因 。 在高渗环境下, 枯草芽孢杆菌细胞内合成脯氨 酸途径中的第一个中间产物谷氨酰磷酸是很不稳定 的, 如果 # 以复合体的 %<U 和 # %<4V 能够相互靠*, 形式共同起作用, 则可以尽快的将谷氨酰磷酸催化 [-, W] 。本 进一步合成脯氨酸, 提高脯氨酸合成的速率 研究发现, 枯草芽孢杆菌 W.&=& 的 !"#$+ 基因尽管

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XD 卷

是一个天然的重叠基因, 但仍旧表达出两个单独的 [!!] 。本研究成功构建了融合的 !"#$% 基因。 蛋白质 更有 这样使表达的融合蛋白! "#$%! "#&’ 相互靠*, 利于生物体在高渗胁迫下脯氨酸的快速合成, 从而 提高了细胞抵御渗透压胁迫的能力。由于在设计中 没有改变 !"#% 基因的起始密码子和推测的 () 序 列, 所以 !"#% 基因仍旧会单独表达。由于在真核细 所以如果在真 胞内, 翻译过程不需要识别 () 序列, 则不会表达单独的 核细胞内表达 !"#$% 融合基因, &*+, 蛋白。因此本研究构建的 !"#$% 融合基因可以 用于转基因植物研究, 提高植物的耐高渗胁迫能力。 参 考 文 献

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